Extrazelluläre Vesikel versus gesamtes MSC-Sekretom: Gibt es unterschiedliche Auswirkungen auf pro-inflammatorische Anulus-Fibrosus-Zellkulturen?

Abstract-Text deutsch

Einleitung: Extrazelluläre Vesikel (EV) mesenchymaler Stammzellen (MSC) haben das Potenzial die Zell-Apoptose und Entzündung in Bandscheiben(IVD)-Degenerationsmodellen zu reduzieren, sowie die extrazelluläre Matrixsynthese und Proliferation der IVD-Zellen zu fördern¹. Es konnte gezeigt werden, dass Interleukin(IL)-1β-Priming von MSC die pro-anabole Wirkung des Sekretoms auf die IVD verbessert². Die vorliegende Studie hatte das Ziel, die Effekte von EV versus Gesamtsekretom von MSCs mit oder ohne IL-1β-Priming auf Anulus-Fibrosus(AF)-Zellen im pro-inflammatorischen Milieu zu vergleichen.

Material/Methode: (1) Humane MSC wurden mit oder ohne IL-1β (1 ng/mL) für 48h kultiviert (n=3), aus einem Teil des Gesamt-Sekretoms wurden EVs durch differentielle (Ultra)-Zentrifugation isoliert, gefolgt von einer EV Charakterisierung mittels TEM, dynamischer Lichtstreuung (Morphologie, Partikeldurchmesser Größenverteilung/Polydispersität) sowie CD63 und Calnexin-Analyse mittels Western-Blot. (2) Humane AF-Zellen wurden 48h mit IL-1β kultiviert und entweder mit dem gesamten Sekretom (Sec) oder EV von MSC ohne (Control Sec, Control EV) oder mit IL-1β-Priming (IL-1β Sec, IL-1β EV) behandelt (n=4-8). AF-Zellen ohne Stimulation dienten als Kontrolle. Anschließend wurde die Stoffwechselaktivität der Zellen, die Genexpression von BAX, IL6, IL8, Matrix-Metalloproteinase MMP1, MMP-Inhibitor TIMP1 und Kollagen Typ I (COL1A1) evaluiert. Statistik: One-way ANOVA (p<0,05).

Ergebnisse: Control und IL-1β EV zeigten die typische EV-Größenverteilung (Durchmesser: 105±53 nm, PdI: 0,30; Abb. 1A) und Proteinexpression (positiv für CD63/negativ für Calnexin) (Abb. 1B). Durch IL-1β-Stimulation erhöhte sich die Proliferation und metabolische Aktivität der AF-Zellen, sowie die Expression von IL6, IL8, MMP1 und TIMP1 im Vergleich zu Kontrollen, während BAX und COL2A1 herunterreguliert wurden (p<0,05, Abb. 2). Alle Sec-/EV- behandelten AF-Zellen verringerten die Expression von BAX, IL6 und IL8 im Vergleich zur alleinigen IL-1β-Stimulation. Das MSC Sekretom (mit/ohne Priming) verringert die TIMP1 und COL1A1 Expression (p<0,05). Die IL1β EV Behandlung der AF-Zellen erhöhte TIMP1 (p<0,0001) ohne weitere COL1A1 Verringerung.

Diskussion: Insgesamt zeigte das gesamte MSC-Sekretom eine stärkere entzündungshemmende Wirkung auf AF-Zellen, es verringert jedoch auch die COL1A1 Expression, wobei das Priming zu keinen Unterschieden führte. Isolierte EVs von MSCs mit Priming hatten eine stärkere Wirkung auf den AF-Matrix-Stoffwechsel als auf die Entzündungsreaktion. Ein therapeutischer Vorteil wäre, dass EVs bezüglich ihres Inhalts besser standardisierbar sind als das gesamte Sekretom. Unsere Untersuchungen zur Charakterisierung des Proteoms der EVs und des Sekretoms zur Identifizierung potenzieller Effektor-Moleküle bzw. nachgeschalteter Signalwege sind noch nicht abgeschlossen. Danksagung: Deutsche Wirbelsäulenstiftung Referenzen: 1. Piazza et al, 2020. 2. Neidlinger-Wilke et al, 2021.

Abstract-Text englisch

Objective: Extracellular vesicles (EV) secreted by mesenchymal stem cells (MSC) have been shown to reduce cell apoptosis and inflammation in intervertebral disc (IVD) degeneration models and to promote extracellular matrix synthesis and proliferation of IVD cells¹. Additionally, priming of MSC with interleukin (IL)-1β has been shown to improve the pro-anabolic effect of the entire MSC secretome on IVD². Therefore, we investigated the impact of EV versus entire secretome from IL-1β-primed and non-primed MSC on annulus fibrosus (AF) cells in a pro-inflammatory environment.

Material/Methods: (1) Human MSC were cultured with or without 1 ng/mL IL-1β for 48h (n=3), after which EV were purified from the entire secretome by differential (ultra)-centrifugation. EV morphology, particle diameter and size distribution/polydispersity were assessed by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering. CD63 and calnexin expression by EV was analysed by western-blot. (2) Human AF cells were cultured with IL-1β for 48h (n=8). Subgroups of IL-1β-stimulated AF cells were treated with either entire secretome (Sec) or EV from non-primed (Control Sec or Control EV) or IL-1β-primed MSC (IL-1β Sec or IL-1β EV) (n=4-8). Unstimulated AF cells were used as control. Subsequently, cell metabolic activity, gene expression of BAX, IL6, IL8, matrix metalloproteinase MMP1, MMP inhibitor TIMP1 and collagen type I (COL1A1) were evaluated. Statistics: one-way ANOVA (p<0.05).

Results: Both Control and IL-1β EV displayed typical size distribution (diameter of 105±53 nm, PdI of 0.30; Fig. 1A), expressed the positive EV marker CD63 and did not express calnexin, a negative EV marker (Fig.1B). IL-1β stimulation of AF cells increased cell proliferation and metabolic activity, as well as expression of IL6, IL8, MMP1 and TIMP1 versus control, while downregulating BAX and COL2A1 (p<0.05, Fig. 2). All treatment groups decreased BAX, IL6 and IL8 expression by AF cells compared to IL-1β stimulation alone; but the secretome from primed and non-primed MSC also downregulated TIMP1 and COL1A1 (p<0.05). AF cell treatment with IL-1β EV upregulated TIMP1 (p<0.0001) and did not further decrease COL1A1.

Conclusion: Overall, the results demonstrate a stronger anti-inflammatory effect of entire MSC secretome on human AF cells, but also on COL1A1 downregulation, with no priming differences. Interestingly, the EV from primed MSC (IL-1β EV) may have a stronger effect on AF matrix metabolism than on the inflammatory response. A therapeutic advantage would be that the EV are more standardisable in terms of their content than the entire secretome. Investigations of the proteomic content of the EV and secretome to identify potential effector molecules/subsequent pathways is ongoing. Acknowledgment: Deutsche Wirbelsäulenstiftung. References: 1. Piazza et al, 2020. 2. Neidlinger-Wilke et al, 2021.