26. Kongress des Medizinisch-Wissenschaftlichen Beirates der Deutschen Gesellschaft für Muskelkranke (DGM) e.V.

Prof. Dr. med

Vorsitz

Prof. Dr.

Prof

Results from a nationwide health-related quality of life study in patients with spinal muscular atrophy

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Objectives: To estimate self-assessed health related quality of life (HRQoL) of patients with spinal muscular atrophy (SMA). Methods: Online survey via national SMA registry in Germany. Estimates of self-reported HRQoL of the EQ-5D-5L rating scale (VAS score: visual analog scala) as well as utility score (preference-based estimate from members of the general population) were stratified by current best motor function (i.e., non-sitter, sitter, and walker). Results: A total of 82 adults (mean age 43 years, SD 15,06) and 7 children (mean age 15 years, SD 1,40) completed the questionnaire: 10% non-sitter (1 SMA1, 6 SMA2, 2 SMA3), 58% sitter (3 SMA1, 26 SMA2, 29 SMA3), 22% walker (21 SMA3). 75 % of participants were on disease specific medication. Mean VAS score for adult participants was: non-sitter 69,71 (SD 22,19), sitter 71,4 (SD 21,75) and walker 63,95 (SD 21,96). Higher incidence in pain/discomfort domain was found on walkers (32%) compared to sitters (19%). The mean total utility score was 0,51 (SD 0,27, range -0,55 – 1). Mean VAS score for children was: non-sitter 87,5 (SD 3,54), sitter 64,67 (SD 25,01), walker 90 (SD 0). The mean total utility score was 0.54 (SD: 0.31, range: 0.30–1.00). Conclusions: Estimates of self-reported HRQoL were higher in children than in adults with SMA, with exception of sitter group. As expected, mean utility scores were similar. Further deep analysis to better understand impact of specific disease therapies and disease burden are needed.

Results from a Nationwide Health-Related Quality of Life Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy

Natural history / Study readiness bei NME

Versorgungsstrukturen

Orales Poster

Dr. med.

PD Dr. med.

Univ.-Prof. Dr. med. Dr. rer. nat.

A simplified murine model of experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG)

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Background and aim Myasthenia gravis is an autoantibody-mediated disease of the neuromuscular synapse characterized by aberrant activation of the complement system. Current models require extensive antigen preperation. To better characterize the underlying pathophysiology, we employed an immunization model with recombinant human acetylcholine receptor subunit alpha (CHRNA1) protein. Methods For this project, we induced experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG) in a total of 10 mice at 8 weeks of life, as well as at 12 weeks of life using CHRNA1 and Complete Freund's Adjuvant (CFA). Controls received CFA and PBS only. We tested the forefoot grip strength before and after exercise with a grip-strength meter (GSM) twice a week and validated our model using triple immunofluorescence staining of the muscle sections with DAPI, C3 and α-Bungarotoxin. Results We detected decreased grip strength in seven out of ten EAMG mice as compared to controls starting with the second immunization in week 12. Three out of 10 mice displayed an EAMG score of at least 1. Analysis of three muscle specimens by immunofluorescence staining demonstrated accumulation of complement (C3) at the neuromuscular junction at all three as evidenced by alpha-bungaratoxin labeling. C3 deposition was not detected in controls. Conclusion Taken together, our protocol allows for the induction of EAMG using recombinant ACHR as a simplified and robust model of MG.

A simplified murine model of experimental autoimmune myasthenia gravis (EAMG)

Biomarker - molekular, klinisch, digital

Pathophysiologie und molekulare Mechanismen

Prof. Dr. med.

RNAseq in Emery-Dreifuss Muskeldystrophie – Pathway Analyse zur Identifikation des Pathomechanismus

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Einleitung Emery-Dreifuss Muskeldystrophie (EDMD) ist eine Muskelerkrankung, bei der verschiedene Kernmembranprotein-kodierende Gene mutiert sind. Mögliche Erklärungen für den Pathomechanismus beinhalten Beeinträchtigungen der zellulären mechanischen Stabilität, generelle Genexpressionsveränderungen und veränderte Signalwege. Es ist bisher nicht geklärt ob die verschiedenen Proteine, die mutiert sind, und die verschiedenen Mutationen, einen einheitliche zelluläre Pathologie verursachen. Material/Methoden Muskelzellkulturen von 10 EDMD-Patienten (mit Mutationen in 7 verschiedenen Genen) und Kontrollen wurden differenziert. Aus isolierten Myotuben wurde RNA gewonnen und sequenziert. Die RNAseq Daten wurden mittels Pathway-Analyse untersucht. Einzelne Ergebnisse wurden in einem erweitertem Satz an Patienten- und Kontrollmuskelzellkulturen in vitro verifiziert. Ergebnisse Obwohl zwischen den einzelnen Patientenzellkulturen unterschiedliche Gene fehlreguliert waren, konnten einheitlich veränderte Pathways identifiziert werden. Es waren Fibrose, Metabolismus, Splicing, und myogenes Signalwege waren in allen Patienten verändert. Dabei konnten die Patienten basierend auf der molekularen Signatur in Untergruppen unterteilt werden. Diskussion Wir konnten neue pathologische Veränderungen sowie einheitlich veränderte Pathways in EDMD identifizieren. Abgesehen von den neuen Erkenntnissen zur Pathologie können diese Daten potentiell für die Etablierung prognostischer Biomarker genutzt werden.

RNAseq in Emery-Dreifuss Muskeldystrophie: Pathway Analyse zur Identifikation des Pathomechanismus

Dr. rer. nat.

PD Dr.rer nat

Impaired proteostasis and unfolded-protein response activation in skeletal muscle of systemic sclerosis patient

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Introduction Systemic Sclerosis (SSc) is a rare autoimmune disease characterized by obliterative vasculopathy, accumulation of ECM proteins, fibrosis and inflammation, as well as specific autoantibodies. Almost any organ may be affected, leading to potentially life-threatening complications such as interstitial lung disease, gastrointestinal failure or pulmonary arterial hypertension. The exact molecular mechanisms contributing to the manifestation of SSc are still incompletely understood, but ER-stress and UPR-activation have been demonstrated in patient-derived PBMCs. Methods Here we aim to unravel the impact of perturbed protein homeostasis in SSc-associated myositis by unbiased proteomic profiling of SSc skeletal muscle tissue. Confirmational studies are based on immunostaining and qPCR. Results Proteomics on SSc muscles allowed quantification of 2290 proteins with 216 of them being significantly dysregulated: 14 of these proteins are directly involved in ER-homeostasis and UPR activation. Additional 15 proteins belong to proteolysis. Histological validation of these analyses confirmed these findings and showed up-regulation of UPR-branches, chaperones and aggregation markers. Summary We here add altered protein response with strong up-regulation of UPR-mediated pathways on gene, as well as protein level in skeletal muscle of SSc patients to the pathophysiological spectrum of the disease and thus expand the current understanding of the underlying disease mechanism.

Varia

Komplementablagerungen an der neuromuskulären Endplatte bei LRP4-positiver Myasthenia gravis

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Einleitung: Myasthenia gravis (MG) ist eine seltene Autoimmunerkrankung vermittelt durch gegen postsynaptische Strukturen der neuromuskulären Endplatte (NME) gerichtete Autoantikörper. Die pathogenetische Beteiligung des Komplementsystems hängt vom IgG-Subtyp ab. Acetylcholinrezeptor-Antikörper (AchR-Ak) sind vom IgG1-Subtyp und können die Komplementkaskade aktivieren. MuSK-Antikörper sind hauptsächlich vom IgG4-Subtyp und können die Komplementkaskade nicht aktivieren. Der führende Pathomechanismus von LRP4-Ak ist vermutlich eine Beeinträchtigung der postsynaptischen AchR-Clusterbildung durch eine gestörte MuSK-LRP4-Interaktion. Andererseits sind LRP4-Antikörper vom IgG1-/IgG2-Subtyp und damit potentiell in der Lage die Komplementkaskade zu aktivieren. Die pathogenetische Beteiligung des Komplementsystems bei LRP4+-MG wurde in dieser Studie untersucht. Methoden: Untersuchung von C5b-9-Ablagerungen mittels immunhistochemischer Färbungen in Interkostalmuskelbiopsien von LRP4+-MG-Patient*innen. Ergebnisse: Interkostalmuskelbiopsien von sechs LRP4+-MG-Patient*innen wurden untersucht. Zwei Patient*innen waren doppelt seropositiv für AchR- und LRP4-Ak. In allen Biopsaten konnte C5b-9 an der NME nachgewiesen werden. Zusammenfassung: Bei LRP4+-MG ist ein Komplementvermittelter Pathomechanismus involviert. Eine gezielte Komplementinhibition (z.B. Eculizumab) ist daher eine mögliche Behandlungsstrategie in dieser Patient*innen-Gruppe.

Massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung der proteomischen Komposition von Targetfasern – Ein histologische Phänomen als Korrelat myofibrillärer Reorganisatonsprozesse

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Einleitung: In neurogen veränderten Muskelbiopsien finden sich häufig Targetstrukturen in Typ 1-Fasern. Die molekularen Hintergründe dieses histologischen Phänomens sind noch weitestgehend unklar. Methode: Targetfasern und Kontrollproben wurden mittels Lasermikrodissektion aus 20 Muskelbiopsien mit einer neurogenen Muskelatrophie isoliert. Die Proben wurden mit einem massenspektrometrischen Verfahren proteomisch analysiert. Die Ergebnisse wurden durch Immunfluoreszenzstudien validiert. Zudem wurden mögliche neue Interaktionen zwischen den identifizierten Proteinen untersucht. Ergebnis: Es konnten mehr als 1000 Proteine identifiziert werden. Unter diesen waren in Targets im Vergleich zu den Kontrollproben 55 Proteine überrepräsentiert und 40 Proteine unterrepräsentiert. Die überrepräsentierten Proteine stehen im Zusammenhang mit der Z-Scheibe, Aktindynamik, Myosinen, Proteinbiosynthese und Proteinqualitätskontrolle. Die unterrepräsentierten Proteine sind hauptsächlich mitochondriale Proteine. Zudem konnte die Interaktion der Proteine Xin und LIMCH1 nachgewiesen werden. Diskussion: In Targetfasern sind vor allem an der Myofibrillogenese beteiligte Proteine überrepräsentiert. Targetfasern könnten somit das histologische Korrelat von Reorganisationsprozessen sein, die durch Reinnervation ausgelöst werden. Diese Daten erlauben Einblicke in die Regenerationmechanismen von Muskelzellen, welche grundlegend für translationale klinische Anwendungen sein könnten.

M.Sc.

B.Sc.

Univ.-Prof. Dr. med.

Astrozyten im Fokus: EAAT1 vermittelte Glutamat-Toxizität als Triebkraft der Motoneurondegeneration bei late-onset Formen der Spinalen Muskelatrophie

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Einleitung: Krankheitsmechanismen jenseits des SMN-Proteinmangels bei der Spinalen Muskelatrophie (SMA) sind bisher nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Studie wurde die Interaktion von spinalen Astrozyten mit spinalen Motoneuronen (MN) untersucht. Im Fokus stand die Glutamat-Toxizität. Material/Methode: Das hier verwendete Mausmodell reflektiert late-onset Formen der SMA. Es wurden Gewebeschnitte des Rückenmarks angefertigt sowie Astrozyten- und Gewebe-Kulturen aus Wildtypmäusen isoliert. Als translationaler Ansatz wurden humane induzierte Astrozyten mit siRNA-induzierten SMN-Mangel sowie Liqour-/Serumproben von SMA Typ 2/3 Patientinnen und Patienten genutzt. Es wurden Immunfärbungen, Western Blot, Assays, in vivo Behandlungen und Verhaltenstestungen durchgeführt. Ergebnisse: Es konnte eine Reduktion des Glutamat-Transporter EAAT1 in Astrozyten sowie ein Anstieg des Glutamat-Levels im Rückenmark, zeitlich vor dem MN Verlust nachgewiesen werden. Durch die pharmakologische Modulation von EAAT1 in vivo, konnte dieses verringert und der Verlust der spinalen MN in SMA-Mäusen verhindert werden. Die Analyse von humanem Liquor/Serum deutet auf eine mögliche klinische Relevanz der Glutamat-Toxizität hin. Diskussion: Mit Hilfe eines translationalen Ansatzes konnte eine EAAT1-vermittelte Glutamat-Toxizität als Triebkraft des Motoneuronenverlust nachgewiesen werden. Durch die Möglichkeit der pharmakologischen Modulation, könnte EAAT1 ein SMN-unabhängiges Behandlungstarget sein.

Longitudinale Einzelzell Analyse identifiziert zytotoxische T-Zellen im Liquor bei der SMA

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine genetisch determinierte Motoneuronerkrankung, die durch Mutationen des Survival Motor Neuron 1 (SMN1) Gens verursacht wird. Das Medikament Nusinersen ist ein Antisense-Oligonukleotid, das die Überlebensrate und die motorischen Funktionen von SMA Patienten durch eine Erhöhung des SMN-Proteins im zentralen Nervensystem (ZNS) bessert und intra-thekal verabreciht wird. Es gibt Hinweise darauf, dass immunologische Faktoren an der Pathogenese von Motoneuronerkranungen beteiligt sind. Wir untersuchten mithilfe von Einzelzell-RNA-Sequenzierung die Immunzellprofile aus dem Liquor cerebrospinalis von SMA-Patienten vor und nach der Behandlung mit Nusinersen. Im Vergleich zu Kontrollpatienten zeigte der Liquor von unbehandelten SMA-Patienten eine signifikante Vermehrung von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen; mit transkriptionellen Anzeichen von Degranulation. Histologisch konnten CD8+ T-Zellen im Gehirn von SMA Patienten nachgewiesen werden. Nach Therapie mit Nusinersen gab es einen nicht-signifikanten Trend zur Verringerung degranulierte NK- und CD8+ T-Zellen. Zytotoxische Lymphozyten könnten an der Manifestation der SMA beteiligt sein.

PD Dr.

Beyond complement – proteometabolomics identify the versatile consequences of eculizumab treatment in myasthenia gravis

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Introduction: The complement function is not only limited to the mediation of inflammatory signals but is also intimately linked to cellular processes regulating. Consequently, therapeutic ablation of the terminal complement cascade by eculizumab treatment is likely to impact human biology beyond the control of autoimmunity. Methods: We employed an in-depth proteomics and metabolomics approach to dissect the serological profile of anti-acetylcholine receptor-ab MG patients treated with eculizumab compared to patient cohorts treated with azathioprine and treatment naïve patients. Therefore, we included three cohorts with a total of 30 patients (n= 10 per group). Results: Analysis of the serum proteome corroborates eculizumab's efficacy for terminal complement ablation with reduction of free C5, which correlated with the treatment response. Distinct immunometabolic pathways were altered in eculizumab-treated patients, including the oxidative stress response, mitogen-activated protein kinase signaling and lipid metabolism with particular emphasis on arachidonic acid signaling. Consistent with this, leukotriene production was reduced in eculizumab-treated patients. Conclusion: The current study demonstrates that the eculizumab-induced proteometabolome is a valuable model for understanding the influence of terminal complement ablation on human biology and for exploring potential mechanisms shaping treatment outcomes beyond inhibition of innate immunity.

Beyond complement - proteometabolomics identify the versatile consequences of eculizumab treatment in myasthenia gravis

Therapie

PD Dr. med

SMArtCARE: Effekt von Nusinersen auf die motorischen Funktionen bei gehfähigen Patienten mit Spinaler Muskelatrophie

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Einleitung Der Krankheitsverlauf von Patienten SMA hat sich durch die Zulassung von drei krankheitsmodifizierenden Therapien in den letzten Jahren entscheidend verändert. Bislang liegen jedoch nur wenige Daten zum Therapieansprechen bei gehfähigen Patienten vor. Wir berichten über Daten aus dem SMArtCARE Register zu gehfähigen Patienten unter Therapie mit Nusinersen mit einer Beobachtungszeit von bis zu 38 Monaten. Methode Das SMArtCARE Register ist ein krankheits-spezifisches Register mit 64 teilnehmenden Zentren in Deutschland, Österreich und der Schweiz. Einschlusskriterium für die aktuelle Datenanalyse war die freie Gehfähigkeit nach WHO Kriterien vor Therapiestart mit Nusinersen. Primäres Zielkriterium waren Veränderungen im 6-Minuten Gehtest unter Therapie mit Nusinersen. Ergebnisse Es konnten Daten von 231 gehfähigen Patienten in die Analyse einbezogen werden. Während der Beobachtungszeit zeigten 31 von 114 pädiatrischen (27.2%) und 31 von 117 erwachsenen (26,5%) Patienten eine klinisch signifikante Verbesserung der freien Gehstrecke von ≥30 m. Im Gegensatz zeigte sich nur bei zwei pädiatrischen (2.0%) und fünf erwachsenen Patienten (4.5%) eine Verschlechterung der Gehfähigkeit von ≥30 m unter Therapie mit Nusinersen. Zusammenfassung Unsere Daten zeigen unter Therapie mit Nusinersen bei der Mehrzahl der Patienten eine Stabilisierung des Krankheitsprogresses, bei einigen Patienten jedoch auch eine signifikante Verbesserung der Gehstrecke.

Human skeletal muscle organoids model fetal myogenesis and sustain uncommitted PAX7 myogenic progenitors

Abstract-Text (inkl. Referenzen) In vitro culture systems that structurally model human myogenesis and promote PAX7+ myogenic progenitor maturation have not been established. Here we report that human skeletal muscle organoids can be differentiated from induced pluripotent stem cell lines to contain paraxial mesoderm and neuromesodermal progenitors and develop into organized structures recapitulating neural tube development and hypaxial myogenesis. Comparative analyses to in vivo states confirm a pool of hypaxial migrating myogenic progenitors that in a niche dependent manner change their axial/anatomical embryonic developmental program to a fetal myogenic, thereby enabling them to resist specification in a cell autonomous manner, maturate and establish the developmental pool of adult muscle stem cells. Our approach, further validated with patient and CRISPR/Cas9 genome-edited Limb-girdle muscular dystrophy (LGMDR1 ), provides a novel robust 3D in vitro developmental system for investigating muscle tissue morphogenesis and homeostasis in development and disease.

Diagnostische Verfahren

Muscle specific promoters for gene therapy – a comparative study in proliferating and differentiated cells

Abstract-Text (inkl. Referenzen) Background Depending on the therapy approach and disease background, the heterogeneity of muscular tissues complicates the development of targeted gene therapy, where either expression in all muscle types or restriction to only one muscle type is warranted. Muscle specificity can be achieved using promotors mediating tissue specific and sustained physiological expression in the desired muscle types but limited activity in non-targeted tissue. Several muscle specific promotors have been described, but direct comparisons between them are lacking. Here we present a direct comparison of muscle specific DES, MHCK7, miRNA206 and CAPN3 promoter. Materials/Methods To directly compare the muscle specific promotors, we utilized transfection of reporter plasmids using an in vitro model based on electrical pulse stimulation (EPS) to provoke sarcomere formation in 2D cell culture for quantification of promoter activities in differentiated mouse and human myotubes. Results We found that DES and MHCK7 promoters showed stronger reporter gene expression levels in proliferating and differentiated myogenic cell lines than miR206 and CAPN3 promoter. However, DES and MHCK7 promotor promoted gene expression also in cardiac cells whereas miR206 and CAPN3 promoter expression was restricted to skeletal muscle. Conclusion Our results provide direct comparison of muscle specific promotors regarding expression strengths and specificity as this is an important feature for the desired therapy approach.

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