Der zell-spezifische Knockout von endothelialem Ephrin-B2 führt zu aggravierter posttraumatischer Öffnung der Blut-Rückenmarksschranke in der akuten und subakuten Phase nach experimenteller Rückenmarksschädigung

Abstract-Text deutsch

Einleitung: Die posttraumatische Öffnung der Blut-Rückenmarksschranke (BSCB) ist ein entscheidender Pathomechanismus nach Rückenmarkstrauma und deren Erholung ist grundlegend für die Regeneration des Rückenmarks. Das Leitprotein Ephrin-B2 spielt eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Kontakten in der neurovaskulären Einheit, wobei der spezielle Effekt in Endothelzellen nach Rückenmarksverletzungen unbekannt ist. In der vorliegenden Arbeit untersuchen wir die zell-spezifische Rolle von endothelialem Ephrin-B2 in einem Knockout-Mausmodell in der akuten bis subakuten Verletzungsphase bis zu 7 Tage nach Rückenmarkstrauma. 

Material/Methoden: In erwachsenen CDH5-CreERT2-Efnb2lox/lox (KO) und Wildtyp-Mäusen (WT) (m/f; n=66) wurde mittels modifiziertem Aneurysma-Clip (5g, 60s) ein thorakales (Th6/7) Clip-Kompressions-Rückenmarkstrauma oder ein Sham-Trauma (2-Höhen-Laminektomie) induziert. Durch die konsekutive Injektion von Tamoxifen (über 5d) wurde spezifisch in Endothelzellen über den Promotor CDH5 Ephrin-B2 mittels Cre-lox-System ausgeschaltet. Neurologische Untersuchungen erfolgten an den Zeitpunkten 1, 3 und 7d nach Trauma (CatWalk® Ganganalyse, Basso Mouse Scale, n=16). Zusätzlich erfolgten longitudinale in vivo 7Tesla-MRT Aufnahmen sowie histologische Analysen an jedem Zeitpunkt (LFB+H&E, CD31+Evans Blue n=31). Die Integrität der BSCB wurde mittels Evans-Blue-Fluoreszenz Assay quantifiziert (Tecan, n=35). Alle Tierexperimente wurden behördlich genehmigt (G031417). 

Ergebnisse: Die quantitative Analyse der EVB-Extravasation ergab eine signifikant erhöhte Permeabilität der Blut-Rückenmarksschranke an Tag 1 und 3 nach Trauma in Ephrin-B2 KO im Vergleich zu WT Mäusen (1d:p=0,0107, 3d:p=0,0002). An Tag 7 zeigte sich kein signifikanter Unterschied mehr (7d:p=0,1785). Die neurologischen Untersuchungen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen KO und WT Gruppe, wobei bis zu Tag 7 keine relevante Regeneration der Hinterpfoten-Aktivität erreicht wurde (1-7d:p>0.05).

Diskussion: Ephrin-B2 spielt eine entscheidende Rolle in der Erhaltung der Integrität und der Regeneration der BSCB nach Rückenmarkstrauma, und der zell-spezifische Knock-Out in Endothelzellen führt zu einer aggravierten sekundären Rückenmarksschädigung in der akuten und subakuten Phase nach Trauma. Zur Beurteilung des Einflusses auf die neurologische Regeneration nach Rückenmarkstrauma ist die Evaluation längerer Beobachtungszeiträume vonnöten.

Abstract-Text englisch

Background: The disruption of the Blood-Spinal-Cord-Barrier (BSCB) is a leading pathophysiology in traumatic Spinal Cord Injury (SCI), and its restitution plays a crucial role in spinal cord regeneration. The guidance molecule Ephrin-B2 promotes cell-cell-contacts in the neurovascular unit. However, its specific role in endothelial cells following SCI is unknown. With this study, we characterize the posttraumatic BSCB disruption and restitution dependent on the endothelial cell-specific knock-out (KO) of Ephrin-B2 in a mouse model up to 7d post SCI.

Methods: Adult CDH5-CreERT2-Efnb2lox/lox (KO) and littermate wildtype (WT) mice (m/f, n=66) underwent mid-thoracic (Th6/7) clip-compression SCI via modified aneurysm clip (5g, 60s) or sham-injury (two-level laminectomy). Endothelial cell-specific Ephrin-B2 KO was induced via the promotor CDH5 in a cre-lox-system with consecutive injections of tamoxifen (5d period). Neurobehavioral analysis was performed (n=16) using Catwalk® gait analysis and Basso Mouse Scale at 1, 3, and 7d post SCI. Additionally, in vivo 7Tesla-MRI was performed, and individual specimens were sacrificed for qualitative histological analysis at each time point (LFB+H&E; CD31+Evans-Blue, n=31). BSCB disruption was quantified using Evans-Blue fluorescence assay (Tecan, n=35). Animal experimental permission was granted (G031417). 

Results: Quantitative assessment of EVB-extravasation displayed a significant BSCB disruption in KO SCI animals compared to WT SCI animals at 1d and 3d but not at 7d post SCI (1d:p=0,0107, 3d:p=0,0002, 7d:p=0,1785). Neurobehavioral analyses showed no differences between KO SCI and WT SCI animals, with no significant regaining of hindlimb function in the course up to 7d post SCI in both groups (1-7d:p>0.05).

Conclusion: Ephrin-B2 signaling plays a significant role in BSCB maintenance and repair, as the posttraumatic BSCB disruption is aggravated by the endothelial cell-specific KO of Ephrin-B2, leading to aggravated secondary injury. Whilst no significant recovery of hindlimb function is achieved post SCI up to 7d, analyses of longer recovery periods are necessary to evaluate the impact on functional recovery.