In vitro 3D-Mikrogewebemodell des degenerativen Nucleus Pulposus zur Bewertung der Präkonditionierung von nasalen Chondrosphären für die Regeneration der Bandscheibe

Abstract-Text deutsch

Einleitung Zellbasierte Bandscheibentherapien sind nicht erfolgreich, weil die Degeneration der Bandscheibe die ohnehin schon harsche Mikroumgebung für das Überleben der Zellen noch schwieriger gestaltet. Bisher wurde noch kein zufriedenstellendes In-vitro-System entwickelt, das degenerative Bandscheibenerkrankung (DDD) simuliert, um Behandlungsstrategien der Bandscheibendegeneration mit Zellen zu untersuchen. Ziel dieser Studie ist (i) ein 3D degeneratives Nucleus-Pulposus-Mikrogewebe (NP µT) Modell zu entwickeln und (ii) die Reaktion von Sphäroiden, die mit nasalen Chondrozyten (NCS) gebildet wurden, in diesem Modell zu untersuchen. Es wurden ebenfalls von der FDA zugelassene Medikamente, die das Potenzial haben, die Leistung der NCS in der DDD-Mikroumgebung zu steigern, getestet.

Material/Methode NPµT wurde durch das Poolen von NP-Sphäroiden (NPS; 25'000 Zellen/Sphäroid) mit oder ohne NCS (12'500 Zellen/Sphäroid) erzeugt. NPµT (+NCS) wurde 2 Wochen lang unter DDD-ähnlichen Bedingungen (Entzündung, Hypoxie, Übersäuerung, geringe Glukose) kultiviert. Die Präkonditionierung der NC-Zellen wurde erst in 2D- und dann in 3D-Kulturen durchgeführt. NCs wurden in 2D-Kultur mit Amilorid, Metformin, Celecoxib, IL1-Ra und GDF-5 präkonditioniert (3 Stunden) und für 24 Stunden unter DDD-ähnlichen Bedingungen kultiviert. Für die 3D-Kultur wurden die NCS während ihrer Bildung mit GDF-5, IL-1Ra oder einer Kombination davon präkonditioniert (3 Tage) und 7 Tage lang unter DDD-ähnlichen Bedingungen kultiviert. Histologische und biochemische Analysen wurden durchgeführt, um die ECM-Akkumulation in dem µT zu untersuchen. Ein ELISA-Test (IL-8) wurde durchgeführt, um die katabole Verschiebung innerhalb des µT zu beurteilen. Nach NC- und NCS-Präkonditionierung wurde die relative Genexpression von anabolen und katabolen Markern analysiert (n=3-5).

Ergebnisse NPµT, die unter degenerativen Bedingungen gebildet wurden, akkumulierten signifikant weniger Proteoglykane/Kollagene und erfuhren eine katabole Verschiebung im Vergleich zur gesunden Kontrolle. NCS akkumulierten teilweise ECM im harschen DDD-Mikromilieu. Die IL-1Ra-Präkonditionierung reduzierte die Expression von Abbau- und Entzündungsmarkern (MMP-3 und IL-8) in NCS, die unter DDD-ähnlichen Bedingungen kultiviert wurden. GDF-5 erhöhte die ACAN-Expression in der 2D-Kultur signifikant, aber nicht die Expression von anabolen Genen in NCS. Amilorid, Metformin und Celecoxib haben die Entzündung nicht reduziert.

Diskussion Das 3D-Modell des degenerativen NPµT ermöglicht es den NP-Zellen, sich in eine sphäroidale Organisation zu re-differenzieren, zellproduzierte Matrix zu akkumulieren und eine in vitro DDD-Mikroumgebung zu schaffen. Die NCS produzieren teilweise ECM-Komponenten im degenerativen NPµT-Modell. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Präkonditionierung der NCS für die Erhöhung der ECM-Akkumulation in der DDD-Mikroumgebung wesentlich ist, IL-1Ra scheint ein vielversprechender Kandidat zu sein.

Abstract-Text englisch

Introduction Cell-based intervertebral disc (IVD) therapies are not successful because the degeneration of the IVD makes the already harsh microenvironment more hostile for cell survival. No satisfying in vitro system simulating the degenerative disc disease (DDD) has been engineered yet to study IVD cell treatment strategies. Therefore, the aim of this study is (i) to develop a 3D degenerative nucleus pulposus micro-tissue (NP µT) model and (ii) to investigate the reaction of spheroids formed with nasal chondrocytes (NCS) within the model. FDA approved drugs with the potential to increase NCS performance within the DDD microenvironment were also tested.

Material/Methods NPµT was generated by pooling NP spheroids (NPS; 25"000 cells/spheroid) with or without NCS (12"500 cells/spheroid). NPµT (+NCS) was cultured for 2 weeks in DDD-mimicking (inflammation, hypoxia, acidity, low glucose) condition. Preconditioning of the NC cells were performed first in 2D and then in 3D cultures. NCs were preconditioned (3 hours) in 2D culture with Amiloride, Metformin, Celecoxib, IL1-Ra, and GDF-5 and cultured for 24h in DDD-mimicking condition. For 3D culture, NCS were preconditioned (3 days) during its formation time with GDF-5, IL-1Ra, or combined and cultured for 7 days in DDD mimicking condition. Histological and biochemical analysis were performed to investigate ECM accumulation in the µT. ELISA (IL-8) was performed to assess the catabolic shift taking place within the µT. After NC and NCS preconditioning the relative gene expression of anabolic and catabolic markers was analysed (n=3-5).

Results NPµT formed in degenerated conditions accumulated significantly less proteoglycans/collagens and experienced catabolic shift compared to healthy control. NCS partially accumulated proteoglycans and collagens within the harsh DDD micromilieu. IL-1Ra- preconditioning downregulated the expression of catabolic and inflammatory markers (MMP-3 and IL-8) in NCS cultured within DDD-mimicking condition. GDF-5 significantly increased ACAN expression in 2D culture of NCs but did not upregulate the expression of anabolic genes in 3D cultured NCS. Amiloride, Metformin, and Celecoxib did not reduce inflammation.

Discussion The 3D degenerative NPµT model allows the NP cells to re-differentiate in spheroidal organization, to accumulate cell-produced matrix and to create an in vitro DDD microenvironment. NCS are partially producing ECM components within the degenerative NPµT model. Our results suggest that NCS preconditioning is essential for increasing ECM accumulation within DDD, with IL-1Ra as promising candidate.