Einfluss von Noradrenalin auf menschliche Bandscheibenzellen

Abstract-Text deutsch

Einleitung

Die Bandscheibendegeneration (IVDD), häufigste Ursache für Rückenschmerzen, ist durch Invasion von Blutgefäßen und sympathischen Nervenfasern in der Bandscheibe geprägt. Der relevanteste sympathische Neurotransmitter Norepinephrin (NE) vermittelt seine Wirkung konzentrationsabhängig über α- und β-Adrenozeptoren (ARs). Ihre Expression in IVD-Zellen wurde bereits nachgewiesen. Die Rolle von NE in der Pathogenese der IVDD wurde noch nicht untersucht. Ziel dieser Studie war es die Wirkung von NE auf IVD-Zellen in vitro zu analysieren.

Material/Methode

Bandscheibengewebe wurde von Patienten im Rahmen einer Spondylodese gesammelt. Die Zellen wurden enzymatisch isoliert und in Monolayerkultur unter Physioxie (2 % O2) kultiviert. Die Zellen wurden mit einer niedrigen (10-8M) und einer hohen (10-6M) NE-Konzentration stimuliert. Die Aktivität der wichtigsten NE-abhängigen intrazellulären Signalwege (ERK1/2, PKA) wurde mittels Immunoblotting nach Kurzzeitstimulation mit NE analysiert. Nach Langzeitstimulation (14 Tage) wurde die Proliferation durch Zellzählung und Zellviabilität mittels LDH-Assay bestimmt. Die Genexpression von Matrixkomponenten (COL1A1, COL2A1, COL10A1, ACAN, COMP), katabolen Matrixmetalloproteinasen (MMP1, MMP2, MMP12), proinflammatorischen Zytokinen (IL1B, IL6, TNF) und der schmerzvermittelnden Substanz P (TAC1) wurde mit qPCR analysiert

Ergebnisse

Die kurzzeitige Stimulation mit NE führte zur Aktivierung der ERK1/2- und PKA-Signalwege. Die Langzeitstimulation führte zu einem signifikanten Anstieg der Zellzahl in der unbehandelten (1,85-fach, p=0,049) und in den NE-behandelten Gruppen (10-8M 2,16-fach, p=0,049; 10-6 M 2,26-fach, p=0,044) im Vergleich zu Tag 0. Der LDH-Assay zeigte keine toxische Wirkung von NE auf IVD-Zellen. Eine signifikante Abnahme der Expression von MMP1 (0,12-fach, p=0,002), MMP12 (0,18-fach, p=0,005) sowie TAC1 (0,06-fach, p<0,001) wurde in der unbehandelten Gruppe nach 14 Tagen im Vergleich zu Tag 0 nachgewiesen. Die Stimulation mit 10-6M NE verursachte eine signifikant verringerte MMP2-Expression (0,54-fach, p=0,03), während 10-6M NE die TAC1-Expression signifikant erhöhte (4,34-fach, p=0,003) im Vergleich zur unbehandelten Gruppe an Tag 14. Die Langzeitbehandlung mit beiden NE-Konzentrationen führte zu einer signifikant geringeren Expression von COL10A1 (10-8M 0,38-fach, p=0,006; 10-6M 0,47-fach, p=0,004) nach 14 Tagen. Die Gene ACAN, COL1A1, COL2, COMP, IL1B, IL6, MMP1, MMP12 und TNF wurden durch die Langzeitstimulation mit NE nicht beeinflusst.

Diskussion

Die Stimulation mit NE führt zu einer Aktivierung der ERK1/2 und PKA Phosphorylierung in humanen IVD-Zellen. Unsere Studie zeigt, dass NE eine komplexe Rolle in IVDD haben könnte, durch Hemmung der Hypertrophie in Chondrozyten (reduzierte COL10A1-Expression) und Matrixabbauprozessen (reduzierte MMP2-Expression) bei gleichzeitiger Zunahme der Schmerzempfindung (erhöhte TAC1-Expression). Weitere in-vitro- und in-vivo-Studien sind nötig.

Abstract-Text englisch

Objectives:

Intervertebral disc degeneration (IVDD) is the most common cause of low back pain. IVDD isaccompanied by invasion of blood vessels and sympathetic nerve fibers. In general, the most relevant

peripheral sympathetic neurotransmitter norepinephrine (NE) exerts its effects in a

concentration-dependent manner via the α - and β -adrenoceptors (ARs). We demonstrated their

expression in IVD cells earlier, however, the role of NE during the pathogenesis of IVDD has not yet

been investigated. Therefore, the aim of this study was to analyze the effect of NE on IVD cells in vitro.

Methods:

IVD samples were collected from patients undergoing a spondylodesis. Cells were isolated

enzymatically and cultured in monolayer under physioxia (2% O2). IVD cells were treated with low (10

-8 M) and high (10 -6 M) NE concentrations. Short-term stimulation was performed to analyze the

activity of the major NE-dependent intracellular signaling pathways (ERK1/2, PKA) by immunoblotting.

After long-term stimulation for 14 days, proliferation was determined by cell counting and cell viability

by lactate dehydrogenase (LDH) assay. Gene expression of structural matrix components (COL1A1,

COL2A1, COL10A1, ACAN, COMP), degrading matrix metalloproteinases (MMP1, MMP2, MMP12),

inflammatory cytokines (IL1B, IL6, TNF), and of the pain-related substance P (TAC1) was analyzed by

qPCR.

Results and Conclusion:

Short-term stimulation with NE resulted in activation of ERK1/2 and PKA signaling pathways with a

peak between 15 and 30 minutes. After 14 days, there was a significant increase in cell number in the

untreated (1.85-fold, p=0.049), as well as in the NE-treated groups (10 -8 M 2.16-fold, p=0.049; 10 -6 M

2.26 fold, p=0.044) compared to day 0. The LDH assay revealed no toxic effect of NE on IVD cells. A

significant decrease in MMP1 (0.12-fold, p=0.002), MMP12 (0.18-fold, p=0.005) as well as TAC1

(0.06-fold, p<0.001) expression was detected in the untreated groups after 14 days compared to day

0. The long-term treatment with both NE concentrations led to significantly decreased expression of

COL10A1 (10 -8 M 0.38-fold, p=0.006; 10 -6 M 0.47-fold, p=0.004) after 14 days. In addition, the

stimulation with 10 -6 M NE caused a significantly decreased MMP2 expression (0.54-fold, p=0.03),

while 10 -6 M NE significantly increased TAC1 expression (4.34-fold, p=0.003) compared to the

untreated group at day 14. The genes ACAN, COL1A1, COL2, COMP, IL1B, IL6, MMP1, MMP12, and TNF

were unaffected by long-term stimulation with NE.

We demonstrated that human IVD cells were able to respond to NE by ERK1/2 and PKA

phosphorylation. Moreover, our results suggest that NE might play a complex role during IVDD by

inhibiting chondrocyte hypertrophy (decreased COL10A1 expression) and matrix degradation

(decreased MMP2 expression) but increasing pain sensation (increased TAC1 expression)